本帖最后由 zxyso4 于 2014-6-7 01:50 编辑

也许有人已经看到过了网上的日本生物学家制作透明染色标本


透明骨骼标本的魅力就在于精确而直观地向我们展示了生物体的骨骼解构与位置犹如X光片一样，并且还是立体的，
也避免了传统的解剖取骨清洗再组装而导致的骨骼相对位置的改变，
同时通过染色将骨骼染成绚丽的颜色，使各种精细结构也展露无遗！
那个日本生物学家也给出了制作方法，但是太麻烦！所用试剂过多！没有一定条件要制作还真是很麻烦，而且有些试剂很贵的 = =（←这才是重点）
其实，透明骨骼染色标本的制作没有那么复杂！特别是小型动物，只用一些基础的试剂就可以制作出非常美丽的标本~！
这些艺术品可以用来当摆件，也可以收藏~而且~我发现很多妹子都超喜欢这样的小礼品，哪怕她是文科生~~（嘿嘿，下面的还用我教你？）
好啦，废话不多说~下面lz我就把我制作标本的过程一步步的发上来！手把手教你做~！
---------------------------------------------------------------我是废话和正题间分割线 = =----------------------------------------------------------------------------------------------
首先当然是试剂准备啦！（我相信在一个常年混KC的KCer的实验室里以下试剂都是常备~）：

蒸馏水（整个制作过程最好都用蒸馏水，制作效果最好！没有？屈臣氏提一桶去~）
95%乙醇
甘油
脂溶性溶剂
氢氧化钾KOH
3%过氧化氢H2O2
茜素红S（万能的TB，25g,18左右）
麝香草酚（万能的TB，25g,18左右）

仪器物品：

制作标本时的反应容器，要能加盖密封
镊子一把
小号注射器一根
承装标本的容器，各种漂亮的玻璃瓶都成~！

接下来是动物体的选择：
尽量采用完整无伤的动物体制作（当然专门制作特殊病理形态除外），不一定要鲜活动物体，甚至不新鲜的尸体都可以，只要骨骼完整。动物体不要过大，体长3~5cm就好，大的可以6~8cm，最好不超过10cm，否则透明效果不好。注意幼年期的动物，骨骼很多还是软骨，染不上色的！（顺便说一句茜素红S是和钙盐结合而染色，所以只有成熟骨组织才能上色）

然后，为了后面制作方便，先配置以下试剂，单独存放，随用随取：
预透明剂：2%KOH水溶液（要多配点，分作以下试剂基础）
染色剂：将茜素红S配制成95%乙醇饱和溶液（溶解度很低但颜色很深，不要加太多染料），将此饱和溶液加入9倍体积1%KOH水溶液内（稀释10倍）
脱色剂：将30%H2O2稀释至3%
透明脱色剂：含1%KOH的20%甘油水溶液（将2%KOH，纯甘油，蒸馏水按5:2:3体积混合）
梯度透明剂：50%甘油水溶液，纯甘油

下面就开始制作啦！（这里用两条鱼做演示）
动物体处死与处理：
鱼类用40度温水处死，不能用开水，处死后在流水中刮去身侧大部分鳞片，不求刮干净，不剖腹，不去皮。
其他动物可采用窒息的方式处死，处死后剥皮，尽量去尽皮下脂肪，剖腹取尽内脏，注意不要伤及肋骨，冲洗干净

固定：
将处理好的动物用95%乙醇固定，不用整姿，液体量要没过标本（下同，液量均需没过标本），24小时后换新乙醇一次。换乙醇后固定一周以上时间。
鱼类可以在换液的时候顺便剥皮，这时候鱼皮被乙醇固定发硬，可以整块撕下，要不后期剥皮很麻烦！3cm以下的鱼就不用剥皮了


鱼肉鱼鳍都变成白色了，仔细看的话因为95乙醇强烈的脱水作用，还有皱纹 = =

脱脂：
这一步是可选步骤！如果动物体比较大（5cm或以上）或者是肉食性鱼类则需要脱脂，将固定动物的乙醇倒出来另放，用脂溶性溶剂浸泡脱脂48小时以上（可以用丙酮、乙醚、乙酸乙酯等等都可以！只要和高浓度乙醇混溶就可以~如果这些不好找的话，还有一个便宜量又足的选择——香蕉水！随便一个五金铺子三五块就买到一大瓶！），48小时以后倒掉溶剂，把乙醇倒回去浸泡一天以彻底去除溶剂。

脱醇复水：
倒掉乙醇，倒入蒸馏水将标本浸泡至残余乙醇完全溶出标本沉底为止，其间不时摇晃容器并换水1~2次，最后一次换水以后泡一晚上。

标本因为富含酒精而浮起来，要一直泡到沉下去为止！

预透明：
倒掉蒸馏水，倒入2%KOH溶液预透明，要随时观察，当标本整体变为半透明以后后再过一小时左右容器底部会有有少量血水流出，此即标志透明时间合适。（大约4小时左右），过度透明的话会散架的。。。。



对比明显，KOH一倒进去薄弱的地方立刻变得透明起来~然后逐渐向厚的地方扩展~


透明到这种透明程度（对着光看）以及底部有黄色血水流出就说明时间够了
同时因为碱的作用，鱼鳍会尽数展开，所以前面不用担心鱼鳍缩起来
要注意的是透明以后标本整体已经非常柔软易碎，此后所有步骤必须避免直接接触标本，小心操作！换液也要快而且轻，尽量保证标本一直处于液体环境中，因为它已经软来撑不起自己的体重了。。。。

染色：
倒掉KOH溶液，倒入染色液，染色时间冬天48~72小时，夏天24~48小时。



黄色的茜素红酒精溶液一加入KOH立刻变成深紫红色，随pH而变色~

脱浮色：
染液可以重复用的，用蒸馏水洗去标本表面浮色，并用蒸馏水浸泡标本直到无浮色溶出标本肌肉呈淡粉色为止（约两天），看着颜色深了就换水。




刚开始用水洗的时候隔一会儿浮色就把水染的很深，所以要勤换水


一直要泡到像这样没有浮色了才可以！

脱色：
倒掉蒸馏水后，倒入3%H2O2脱色，脱色时会产生大量气泡使标本浮起。脱色时间以标本软组织完全脱去颜色，以及身体上的黑色部位（如眼睛、鱼鳍等）全部变为黄褐色为准，越长越好。

标本里面会产生很多泡泡，所以浮起来成这样一个奇葩姿势，不过在这里我发现一个不同，那条小鲶鱼是尸体制作的，从始至终基本上就没有泡泡！

这是一组对比，上面的鰟鮍没有用H2O2脱色，直接进入下一步，可以看到肌肉的颜色完全脱掉了，但整个头部，特别是眼睛，色素沉积还是非常严重，显得黑黑的，鱼皮也有点泛黄
而下面的食蚊鱼用H2O2脱色后好很多，眼睛自身的黑色素也给脱去了，鱼皮也没有颜色，整个要清新、干净得多。

精处理：
在脱色后将标本连带双氧水倒入培养皿里，如果是小鱼前面没有剥皮的话，此时鳞片亦被染成红色，很容易就去除没有刮干净的鳞片，标本体内生成的气泡用小注射器穿刺吸出来，吸掉大的气泡就可以了，小的不用管。处理后小心地将标本放回容器，用蒸馏水浸泡过夜除尽双氧水。


一定要连水一起倒出来，标本很脆弱的这时候！去鳞很好去，都不用刀，镊子尖轻轻一刮就好了


LZ就是前面没有剥皮，这会儿剥皮麻烦死了！标本已经软得根果冻一样！完全没有着力点！

再脱色与透明：
倒掉蒸馏水，倒入20%甘油透明脱色剂进一步与脱色与透明，倒入后因为密度差异，标本会浮起来，先平置容器15分钟待标本沉下后再恢复直立。透明时间为一周左右，待软组织浮色去尽，黑色部分（眼睛）由黄褐色变为透明或浅黄色后即可。大概要一周左右！这个透明剂里也有KOH！时间太长也会散架的哦！而且，标本体内的小气泡会在此步中缓慢溶解掉，最后全部消失。


先横放一会儿，要不然标本浮起来会折起来的，放个10来分钟就沉下去了

这里是lz血的教训啊！！！[s:441] lz嫌大鱼透明得慢就给它水浴加热了一下！！结果！不到半小时整体散架了！！！[s:441] 再次深切提醒心急吃不了热豆腐[s:441]
不加热的放一周多都没问题的！而且越来越透明！

梯度透明
倒掉20%甘油，倒入50%甘油（不含KOH），透明约一周左右，再用纯甘油彻底透明，一周以上。这一步要注意：50%及以上浓度甘油粘稠，对流不易，要不时振摇容器使标本中的低浓度甘油彻底溶出。同时气泡在甘油里面不会溶解，所以这一步一定要小心不要代入气泡。

同样每次换高浓度后要平躺一会儿~刚放进去因为密度差异，还看得到透明的肉~

慢慢甘油渗进去以后就会变得很透明了~
怎么样，已经有那么一回事了吧~？

最后就是装瓶啦~
用新的纯甘油把标本浸泡在选好的标本瓶里密封，放一粒麝香草酚晶体防腐就大功告成了~（晶体会慢慢溶解掉）

这样就大功告成了！（还可以看到那一粒麝香草酚晶体~）

头部

身体

尾鳍

胸鳍以及小得不能再小的腹鳍~（鲶鱼从肚子一直连到尾巴的是臀鳍）

鲶鱼背鳍已经退化，只在脊椎骨那里有一点点背鳍骨的残迹~

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下面是楼主做的其他的一些成品~也发上来给大家看看~~~

一只胖头鱼的鱼苗~

蛙


鰟鮍


食蚊鱼（平时拿来作饲料鱼的）



胖头鱼和鰟鮍都是鲤科鱼类~鲤科鱼类每个肌节间都有Y形肌间刺，没错就是张爱玲“一恨鲫鱼多刺”的刺，这个用一般方法可是真不好显示啊~~~
中过招的童鞋自己举手~


鲤形目和鲇形目的最前面1-3枚脊椎骨的某些成分会变异形成一组具有特定功能骨片，叫做韦伯氏器。
其实就是连接鱼鳔和内耳的听骨链，这样鱼鳔感受到的震动可以传达到内耳形成听力！增强感知范围！


食蚊鱼属鳉科，每根肋骨上都有个小岔~


没想到1、2cm长的吃杂物的食蚊鱼也是有“牙齿”的！


蛙类也有“牙齿”


蛙“手”。。


最后来一张展示全家福~

总结：
其实透明骨骼标本的制作一点都不难，试剂也好找，虽说总体做下来要耗费大概一个月左右，但其实其中大部分时间都是在等它自己反应而已。
我们只要算好天数去换个液或者摇一下就是了，一点也不费事。而且！可以同时做！一做就是一批！只要提前把试剂配好，一批一批的做都可以大量产出了。。。就是比较费酒精，不过我相信这也不是个问题。。。
最后呢就是想说楼主这个方法和那个日本科学家的方法不冲突，楼主的方法比较适合小型鱼，简单方便，而大型鱼还是要靠日本的方法，要用胰蛋白酶消化掉大量的肌肉，而且做出来还没有小鱼这么晶莹剔透。
同时日本方法还加了 阿利新蓝 这个是软骨染色剂，可以把软骨染成蓝色，而硬骨是红色更漂亮，特别是对于软骨鱼类和幼体动物（鲨鱼，鳐鱼之类的），骨骼都是软骨，非要阿利新蓝才能上色！ 但唯一的缺点就是阿利新蓝好贵的。。。一克就要一两百。。。楼主没米所以就不用了。。。。这样已经很好了不是吗~？
想要用的童鞋在标本固定好以后复水之前用阿利新蓝酒精溶液泡一天就可以了，其他步骤完全一样。