试管里的进化——我想当上帝（实验设想）

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试管里的进化——我想当上帝（实验设想）

diy患者2011/06/10农业 IP:山东

这个是七八年前的设想。写的很罗嗦，看看吧，不喜欢就跳过去，喜欢的可以照我的思路继续做下去。有时间我也想继续做下去。七八年前的东西，错误不少，也懒得改了，凑合看吧，欢迎提意见。

试管里的进化

——长期热激对大肠杆菌基因的影响（实验设想）

前言：作为生物学支柱学科进化论从其诞生的一刻起就伴随着争论，现在进化作为一个事实已经从化石，分子生物学，发育学等各门学科所证实，但进化的机理和过程，却是个争论不休的问题。作为一门自然学科，进化论有很强的思辩性。因为时间的原因，人们很难去观察记录自然界中发生的进化现象，只能通过观察结果去推测过程。达尔文在其《物种起源》中利用家养动物的变异去正式其理论。但家养动物的育种者，都是些普通的人，难免出现记录不清的现象，而且很多家养动物驯化了很长时间，早已经没有记录。一个比较系统的观察的例子是对伦敦郊区蝴蝶黑化的研究，在污染比较严重的情况下，黑色蝴蝶占的比例比较多，而当污染比较轻的情况下，白色占的比例就增加了。这是综合进化论（The modern synthetic theory）的一个证据。随着分子生物学的发展，1968年日本人木村资生（M. Kimura）,根据分子生物学的研究，主要是根据核酸、蛋白质中的核苷酸及氨基酸的置换速率，以及这些置换所造成的核酸及蛋白质分子的改变并不影响生物大分子的功能等事实，提出了分子进化中性学说（Natural Theory of Molecular Evolution）。1969年美国人J.L. King和T. H. Jukes用大量的分子生物学资料进一步充实了这一学说。

中性突变在实践中获得很大成功，根据此理论，我们可以建立物种之间的亲缘关系，且跟化石符合的很好。但中性突变理论对传统的进化论提出很大的挑战，其中之一，是他认为进化跟环境和世代无关，而只跟时间有关。而传统的观点正好相反。

其实这两种理论并非水火不容，人们推测跟适应无关的基因是进行中性突变，而跟适应相关则是进行自然选择。本实验就是利用大肠杆菌这一模型动物长期使其生长在高温下，看它能否适应高温环境，如果能成功的将最适温度提高，我们就可以选择性的找几个基因，进行测序，看其是否发生突变。进而分析其突变是否于其对热适应相关。

一、国内外研究状况：

国内外最热适应研究都较少，国内注重实际应用，以酵母为材料，提高起适应温度，以利于其更好的发酵酒精，主要是从生理的角度探讨其耐热的机理。国外的Michigan大学的微生物生态中心实验室在大肠杆菌的热适应方面做了多年的工作，但主要是从生理生态的角度出发。未看到从核酸角度进行研究的文章。

二、研究方法：

通过不断的增加环境温度，筛选出能适应高温的大肠杆菌。然后通过克隆测序，分析突变的意义。

三、难点及解决方法：

（一）获得耐高温大肠杆菌的方法：

提高大肠杆菌的适应温度有两种方法。其中一个就是，Michigan大学的生物学实验室发现，大肠杆菌在临界温度下，会产生“反弹”现象，就是最初几天，大肠杆菌的数量会下降，但某些试管会在五六天后出现细胞数量反弹的现象。这种现象应该是大肠杆菌的某个基因发生突变，导致其适应热环境能力提高的结果。第二个方法就是，使用温度梯度平板。但现在没有现成的一起，我们必须自己做一个，其实一个水浴锅就是一个温度梯度。将水浴锅加满水，平板的一端放在水上面，另外一端伸在空气中。然后将水的温度提高到50度-60度。这样在平板上就造成了一个连续的温度梯度。在使用温度梯度平板的时候会出现冷凝水的问题，可以通过加厚的平板，并在使用前适当干燥一下，以提高起吸水的能力。

（二）选择合适的基因为研究对象：

在自然环境下，大肠杆菌的突变很多，但以我们的条件，是很难找得到的。我们只能根据现在的理论，去推测哪个最有可能突变。其次我们要利用那些研究的比较清楚的基因，这样，当我们得到突变进行分析的时候，才不至于束手无策。同时选择我们认为不会突变的基因进行对照。

（三）防止杂菌的污染：

在实验中，因为是使用的临界温度对大肠杆菌进行筛选，如果这时进入一个形态象大肠杆菌的耐高温杂菌，会被当成大肠杆菌，从而导致以前的工作全部白做。同时，没有可靠的鉴别手段，也会使自己的工作的可信程度降低。可以从以下几个方面入手。首先，严格进行无菌操作。其次，给大肠杆菌加上遗传标记，如抗生素筛选标记，Lacz基因等。再次，定期对自己得到的大肠杆菌进行确认。如进行生理生化指标的测定。但大肠杆菌长期热激或许会导致起生理生化指标的一些改变。也可以进行蛋白质电泳，如果是杂菌的话，带型会很不一致的。

四、本人的初步实验：

本人曾使用TOP10菌株进行了初步的实验。在实验中发现，使用反弹法比较麻烦，很难找到临界温度。根据报道，42度对他们所使用的菌株是临界温度，但在42度下，TOP10全部可以生长。在44度下全部不生长。经过自己思考和观察，决定利用水浴锅制造温度梯度，经过4代培养后进行蛋白质电泳鉴定，发现为杂菌。但这次实验对以后实验的改进提供了宝贵的经验。

参考文献：

1.    活泼高温中性蛋白酶及其产生菌的初步研究工业微生物第32卷第二期

2.    华子安金其荣等选育耐高温酒精酵母的研究酿酒第30卷第三期

3.    郦惠燕邵靖宇嗜热菌的筛选及菌种的初步鉴定生命科学第12卷第1期

4.     范玉贞　嗜高温酶及其耐热机制生物学教学

5.    Judith A. Mongold , Albert XXXXnnett and Richard E.Lenski Evolution adaption to XXXXXXXXXXXXXI.extention of the upper thermal limit of  XXXXXXXXXXXXXXli  Evolution 53: 386-394

6.    Vaughn XXXXoper, Albert XXXXnett, and Richard E.Lenski  Evolution of thermal dependence of growth rate of XXXXXXXXXXXXXXli populations during 20,000 generations in a constant enviromen

来自：农林牧渔 / 农业