制备1%琼脂糖凝胶。电泳30min后。浸泡于EB。1h后取出。紫外呈像系统检测
![IMG_1193.jpg]()
图中显示：Marker最后的条带为10kb，基因组DNA为约12kb，符合常规
图中显示：Marker最后的条带为10kb，基因组DNA为约12kb，符合常规
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CTAB & 液氮研磨法提取基因组DNA及其检测与ITS序列扩增
CTAB & 液氮研磨法提取Phanerochaete chrysosporium真菌基因组DNA
提取步骤：
①打开水浴锅65℃，预热CTAB提取液。
②液氮研磨样本，分装入离心管，每管约60mg。
③每管加入700ul CTAB提取液，涡旋混合后，65℃水浴保温1h，每10min摇匀。后取出冰浴5min。
④加700ul酚氯醇(25:24:1)，轻颠倒混匀30min。离心机设4℃, 12000rpm。
⑤离心10min。
⑥取上清600ul，加入氯醇(24:1)600 ul，轻颠倒混匀20min。
⑦离心10min。
⑧取上清550ul，加入氯醇(24:1)550 ul，轻颠倒混匀20min。
⑨离心10min。
⑩加入55ul(1/10体积)的3M NaAc(4℃)与330ul(6/10体积)的异丙醇(-20℃)，颠倒混匀，-20℃沉纯过夜。
图：
液氮研磨：
![IMG_1154.jpg]()
![IMG_1157.jpg]()
![IMG_1170.jpg]()
分装样本后 ，加入预热的CTAB提取剂
![IMG_1194.jpg]()
水浴保温：
![IMG_1195.jpg]()
冰浴5min
![IMG_1203.jpg]()
1h后加入酚、氯仿、异戊醇试剂：
![IMG_1196.jpg]()
高速离心机。eppendorf品牌。值得信赖。
![IMG_1057.jpg]()
氯仿、异戊醇试剂处理
![IMG_1206.jpg]()
醇析出DNA后。在超净台强风干燥
![IMG_1186.jpg]()
提取步骤：
①打开水浴锅65℃，预热CTAB提取液。
②液氮研磨样本，分装入离心管，每管约60mg。
③每管加入700ul CTAB提取液，涡旋混合后，65℃水浴保温1h，每10min摇匀。后取出冰浴5min。
④加700ul酚氯醇(25:24:1)，轻颠倒混匀30min。离心机设4℃, 12000rpm。
⑤离心10min。
⑥取上清600ul，加入氯醇(24:1)600 ul，轻颠倒混匀20min。
⑦离心10min。
⑧取上清550ul，加入氯醇(24:1)550 ul，轻颠倒混匀20min。
⑨离心10min。
⑩加入55ul(1/10体积)的3M NaAc(4℃)与330ul(6/10体积)的异丙醇(-20℃)，颠倒混匀，-20℃沉纯过夜。
图：
液氮研磨：
分装样本后 ，加入预热的CTAB提取剂
水浴保温：
冰浴5min
1h后加入酚、氯仿、异戊醇试剂：
高速离心机。eppendorf品牌。值得信赖。
氯仿、异戊醇试剂处理
醇析出DNA后。在超净台强风干燥
使用Nanodrop检测
该样本DNA浓度为894ng/ul。OD260/280=2.12，OD260/230=2.07
未做纯化，混有RNA残留故 OD260/280值偏高。
做its序列的扩增并不需要高纯度。故不作纯化。
使用TaKaRa的Taq试剂盒
PCR程序
PCR开始了
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赞扬，大爱。。
想请楼主普及一下人民群众喜闻乐见的几个东西：
DNA亲子鉴定的原理、过程、方法；
DNA测序的方法和流程。
如果能用实验做一小段来说明，配合完整的综述就更好了。
想请楼主普及一下人民群众喜闻乐见的几个东西：
DNA亲子鉴定的原理、过程、方法；
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如果能用实验做一小段来说明，配合完整的综述就更好了。
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测序一般都是交给公司去测序的。
测序已有测序仪可以使用了。化学测序十分繁琐。很难一时半会儿讲的清楚。
本实验的目的是提取基因组DNA，并扩增ITS序列的实验操作练习。使用的是已知明确分类的Phanerochaete chrysosporium。
ITS序列是一段在种间具有广泛变异的序列，而两端的rDNA 片段相对保守。故利用rDNA 的保守片段，设计引物its1,its4可以克隆出its全部片段。比对NCBI的数据库，即可得到较为准确的分类学信息。是微生物研究的的必要之举。当然并不能完全依靠分子鉴定。还要结合电镜下的结构学分类信息来综合考量
测序已有测序仪可以使用了。化学测序十分繁琐。很难一时半会儿讲的清楚。
本实验的目的是提取基因组DNA，并扩增ITS序列的实验操作练习。使用的是已知明确分类的Phanerochaete chrysosporium。
ITS序列是一段在种间具有广泛变异的序列，而两端的rDNA 片段相对保守。故利用rDNA 的保守片段，设计引物its1,its4可以克隆出its全部片段。比对NCBI的数据库，即可得到较为准确的分类学信息。是微生物研究的的必要之举。当然并不能完全依靠分子鉴定。还要结合电镜下的结构学分类信息来综合考量
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锡纸包裹研钵，放在干热灭菌锅中，180度8小时。灭菌，除去所有RNase A 等RNA水解酶。
分子实验必须的。
分子实验必须的。
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[s:220] 超净台居然还有这个作用......................................离心机很脸熟,我们学校用的是同一个牌子的高速冷冻,移液器貌似也比较高级,楼主可以开一篇用来专门介绍仪器和药品............................比较有爱
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引用第6楼atlas于2011-10-02 23:07发表的 :
……
180度8小时。
……
[s:225] [s:225] [s:225]
鄙局处理鸽子粪，105度48小时。
真是人比人得死，货比货得仍啊……
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回 8楼(hambaby) 的帖子
180度8小时的目的主要是为了除去RNA水解酶。
RNase A 在湿热灭菌锅中121度4小时，仍可保持活性。
所以一般来说，本实验室采用干热180度8小时来搞定
RNase A 在湿热灭菌锅中121度4小时，仍可保持活性。
所以一般来说，本实验室采用干热180度8小时来搞定
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“基因组DNA为约12kb”
说法不是很严密，实际上利用琼脂糖电泳，超过20Kb的跑的一样快，所以分不出来超过20Kb的片段，而染色体片段是非常大的，在提取过程中会随机打断成非常大的片段，大部分会大于20kb,所以在电泳图上跑的和20Kb的一样快。
你们用的maker是什么marker，怎么跑得不清楚，其实用lamda噬菌体的酶切marker挺好的，价格便宜量又足。
说法不是很严密，实际上利用琼脂糖电泳，超过20Kb的跑的一样快，所以分不出来超过20Kb的片段，而染色体片段是非常大的，在提取过程中会随机打断成非常大的片段，大部分会大于20kb,所以在电泳图上跑的和20Kb的一样快。
你们用的maker是什么marker，怎么跑得不清楚，其实用lamda噬菌体的酶切marker挺好的，价格便宜量又足。
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你这个实验不是提取RNA吧，所以应该不需要这么麻烦，DNA很抗造的。有EDTA就成。
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回 10楼(diy患者) 的帖子
额。是这样的。。。
第一次编帖，内容很多的。你说的问题基本都说到了。但是，科创的速度不给力。第一次做的居然都丢了。由于时间来不及，就没有都补上。。。
后面几天有时间再补回来
第一次编帖，内容很多的。你说的问题基本都说到了。但是，科创的速度不给力。第一次做的居然都丢了。由于时间来不及，就没有都补上。。。
后面几天有时间再补回来
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atlas
学者 笔友
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