1.PCR引物的设计
（1）长度。过长的引物会使延伸温度超过耐热DNA聚合酶的最适温度，过短则会影响PCR的特异性。一般为18-25bp，一对引物差值应小于3bp。
（2）基本成分。G+C在40%-60%，四种碱基应随机分布，避免堆积，尤其是3’端引物，不应有连续的3个G/C互补,否则会使引物与核酸G/C密集区互补，影响PCR特异性。
（3）引物自身。不因出现反向互补序列。或者大于3bp的自身互补序列，否则会出现发夹结构。
（4）引物之间。应无互补序列，尤其是避免3’端的互不重叠，以免形成引物二聚体。（可使用Hot Start PCR / Touch Down PCR避免此问题）
（5）3’末端。引物3’末端是引发延伸的起点。因此一定要与模板准确配对，四种碱基有一定的错配规律，以引物3’末端的A影响最大。另3’末端错配时，不同碱基的引发率存在很大差异。当末位是A时，错赔率低，应避免引物3’末端的第一位是T，引物3’末端最佳碱基选择为G/C，配对较为稳定。
（6）5’末端。引物5’末端并无严格限制。在于模板结合的引物长度足够的前提下，5’末端可不与模板结合，引物5’末端可被修饰，如附加限制性酶酶切位点，引入突变位点，标记生物素等，其PCR产物既含有目的片段，两侧有具有附加片段。
（7）溶解温度。3’末端引物与5’末端引物应具有相似的Tm值，其差值应小于5℃，扩增产物与引物的Tm值差值应小于10℃，以确保扩增产物的有效变性。
（8）引物的特异性。引物与非特异性扩增序列的同源性不超过70%，或者连续的8个bp的碱基同源。
（9）引物的简并性。引物的3’末端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码较少的氨基酸，如Met，Trp，且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于3’末端。


2.引物的用量与计算
在PCR体系中，引物的浓度一般为0.1-0.5mM，这一浓度足以使1kb的目的片段扩增30个循环。引物浓度过低则产量少，浓度高则促使引物二聚体的形成与非特异性产物的形成。
引物浓度的计算：
摩尔猝灭系数（Em）是在1cm光程的比色杯中测定1M的寡核苷酸在UV260nm的OD值.
Em=16000A+23000G+7000C+9600T
Eg:    一纯化的24bp寡核苷酸溶于100ul ddH2O中，取10ul定容1000ul，测定OD260nm=0.76，则原液OD值为0.76*100=76.
    若A=G=C=T=6，则Em=267600
    故原液中寡核苷酸浓度为：76/267600=340nM

3. Thermostable DNA Polymerase
Taq DNA Polymerase
由Thermus aqusatics YT-1分离得到，该酶基因2499bp, 编码分子94kDa，共823个氨基酸残基。
（1）热稳定性。Taq pol在92.5℃，95℃，97.5℃下半衰期分别为130min，40min与5min，若设设每循环热变性时间为30s-60s，则30轮循环的累积变性时间为15-30min，所以Taq pol仍可保持较高活性。
（2）高催化活性。Taq pol 可达200000U/mg，催化的最适温度为75-80℃，150-300个bp/(s*酶分子)，70度约为60个bp/(s*酶分子)，55度约为22个bp/(s*酶分子)。
（3）忠实性。Taq pol 与 XXXXli pol I的N端区域（此区域与该酶具有5’-3’外切活性有关）高度同源，由于Taq pol无XXXXli pol I的3’-5’外切酶活性区的同源序列。因此Taq pol不具有Klenow酶的校对功能。再起催化的PCR扩增过程中引起的碱基错配的几率大大增加了。通常，Taq pol在PCR反应中出现的碱基错配率为1/300~1/18000，经过25个循环后，扩怎产物的序列中，每400个就有一个与原始序列不同。
（4）反转录活性。当Mg2+在2~3mM，68℃时，Taq pol具有类似反转录酶的活性，若有Mn2+则更佳。若体系中没有Mn2+ 则可直接使用Taq pol进行150~250bp的反转录。
（5）非模板依赖的聚合活性。Taq pol有类似脱氧核糖核酸末端转移酶（TdT）的活性。可在新形成的双联产物的4’末端加上一个非模板依赖的碱基，在4中dNTP中，Taq pol对dNTP的聚合能力最高，在标准的PCR条件下，产物4’末端的非模板依赖碱基通常为A，利用这一特性我们能够构建d/T载体来克隆带有dA尾的产物。
    用Klenow酶可将3’端的非模板依赖的聚合碱基去掉。PCR程序结束后，加热到99℃ 10min灭活Taq pol，调整Mg2+至5~20mM，加入1~2U XXXXli DNA pol I Klenow片段，室温反应5-10min。