答问:
1.内切酶
这是一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶(DNase),它们的切点大多很严格,要求专一的核苷酸顺序内切酶—识别顺序。长期以来,难以深入研究的DNA大分子,借此可以切割成特定的小片段来分析。
第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。
第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA 片段,并能构建来自不同基因组的DNA 片段,形成杂合DNA分子。因此,这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
第二类内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。
第三类内切酶也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA 片段,具有各种单链末端。
2.外切酶
核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键,降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸(DNA为dNTP,RNA为NTP)。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。
3. Klenow片段
(克列诺片段,Klenow fragment或称克列诺酶,Klenow enzyme):XXXXli DNA pol I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性,但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。
它可用于填补DNA单链末端成为双链。如果供给32P标记的三磷酸核苷酸,则可使DNA带上同位素标记。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA 片段,要用被切成平头末端的DNA 片段连接时,可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头,然后在DNA连接酶作用下把两个DNA 片段连接起来。