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小球藻异养培养的研究进展
闫 海,张 宾,王素琴,李雅雯,刘 硕,杨 帅
(北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系,北京100083)
摘要:单细胞绿藻在水产养殖、环境保护、人类健康食品和重要生命活性物质生产等众多领域的研究与应用得到不断扩展,而如何高效培养出超高细胞浓度小球藻来满足各个应用领域的需要是我国亟待解决的藻类生物技术关键课题。主要针对小球藻的异养培养和重要生命活性物质的生产等方面的国内外最新研究进展进行了综述,并对重要的研究领域进行了展望。
关键词:小球藻;异养培养;生命活性物质
作为最简单的光合作用有机体,微藻有时又被称为单细胞藻类。微藻中的小球藻是一种具有重要经济价值的生物资源,有着巨大的应用和开发潜力。小球藻富含蛋白质、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、叶黄素、虾青素和多种维生素,具有极高的营养价值和提高免疫力的功能。另外小球藻还含有一种非常重要的成分———小球藻生长因子,它既具有诱发干扰
素、激发人体防御和免疫组织中的巨噬细胞、T 细胞和B 细胞的功能,又具有促进人体对环境污染有害物质解毒和排泄的作用[1 ] 。微藻属于低等植物,主要吸收二氧化碳通过光合作用合成有机物,但采用此种方法培养出的藻细胞浓度一般较低。进入20世纪70 年代以来,国外学者发现,有些小球藻可以在无光照条件下生长于有机物中[2 - 3 ] ,这不仅大幅度提高了小球藻的生长速度,而且获得了很大的藻生物量,从而引起了单细胞藻类培养的一次重要革
命。当前,美国、日本、以色列等国家和我国台湾地区等已成为小球藻的主要生产地,而我国大陆尚未发现有超高细胞浓度小球藻异养培养产业化生产的报道。
1 小球藻的培养
111 自养培养
1890 年荷兰微生物学家Beijerinck 等首先在琼脂平板上成功分离得到了小球藻的纯培养物。Otto Warburg 于1919 年将这一纯培养物在实验室进行纯培养,作为研究植物生理学的材料,研究发现,小球藻可以进行光合作用,从而为小球藻的自养培养研究拉开了序幕。小球藻的自养培养既可利用自然光,也可利用人工光照,培养基主要由无机化合物组成,最适pH 为615～715 ,最适光照强度为36～90μmol/ (m2·s) ,温度为20～30 ℃。于贞等[4 ]的研究结
果表明,pH 是影响小球藻生长的重要因素,光照强度和通气量通过影响小球藻光合作用强度而调节小球藻的生长。小球藻可以利用铵盐、硝酸盐和尿素作为氮源,添加适量的含有痕量有机酸和微量元素的土壤浸出液有利于小球藻的生长。
112 异养培养
异养培养与自养培养最大的区别是前者利用有机物作为碳源和能源,对小球藻异养培养的研究较自养培养起步晚。1953 年,Lewin 等[5 ] 首先发现了一些藻类能利用有机物作为唯一碳源和能源进行异养生长,目前对微藻异养生长机理的研究还处于初级阶段。Gladue 等针对有些微藻不能进行异养生长这一现象推测有3 种假说: ①缺乏利用有机物的酶类,如一些微藻缺乏利用某些有机物的酶。②通透性障碍。有机物必须通过细胞膜进入细胞内部才能被藻类利用,然而有些藻类缺乏吸收有机物的机制,为了克服这一问题,必须选取合适的有机物。③限制性的呼吸能力。藻类通过呼吸作用分解自身储存的物质,获得能量,维持细胞的存活。然而,有些藻类在异养条件下呼吸所产生的能量不足以维持生长及运输外界环境中的有机物。Endo 等检测了小球藻利用包括糖、有机酸和醇类等60 多种有机碳源的能力,结果表明,只有葡萄糖、半乳糖、乙酸、乙醇、乙醛、丙酮酸可分别作为唯一碳源支持小球藻的生长,其中葡萄糖、半乳糖和醋酸盐可在无光照条件下支持蛋白核小球藻的快速生长。目前,小球藻异养培养中应用最广泛的培养基是Basal 改良培养基[6 ]和K2N 培养基[7 ] 。
近年来,对于小球藻的异养培养研究受到了众多学者的重视,特别是高细胞浓度培养技术得到了较深入和广泛的探索,取得了一系列重要的研究进展[1 ,8 - 9 ] 。异养培养小球藻可以克服光自养培养的诸多缺陷,是提高小球藻产量与产率的有效途径。笔者所在课题组于2004 年从天然水体中成功筛选出了能够异养生长的小球藻种[1 ] ,发现当小球藻接种量较低时,无论是自养培养还是异养培养,生长都非常缓慢,延迟期达到3 d 以上。当增大初始藻生物量时,在黑暗条件下,小球藻生长迅速进入对数期,培养第2 d 就达到了最大生物量。在高的初始藻生物量培养条件下,无光照异养培养小球藻的生长速度远高于光照培养,因此黑暗异养培养超高细
胞浓度小球藻显示出了非常大的优势和潜力。Shi 等[10 ]研究了不同葡萄糖浓度对小球藻生长的影响,研究结果表明,当初始葡萄糖质量浓度在10～80 g/ L 时,所得小球藻细胞浓度随葡萄糖含量的升高而增大,最大细胞干质量浓度可达3112 g/ L 。但当初始葡萄糖质量浓度达到100 g/ L 时,小球藻的延迟期相对较长,生长受到抑制。Sasaki 等[11 ]在小球藻与细菌混合培养的污水处理体系中研究了葡萄糖浓度对小球藻生长规律的影响,发现当葡萄糖浓度较低时,藻细胞浓度也低,相对高的葡萄糖起始质量浓度(如50 g/ L) 可用于培养高细胞浓度的小球
藻。王素琴等[12 ]的研究结果表明,当初始葡萄糖质量浓度大于1713 g/ L 时,会抑制小球藻的生长,因此推测在用发酵罐发酵培养小球藻的过程中,应该依据小球藻的生长状况和葡萄糖的利用情况进行葡萄糖的流加控制,这样可避免高葡萄糖浓度对小球藻生长的抑制。刘世名等报道,流加分批培养小球藻时,补料液中最适碳氮比为4112。张丽君等[13 ]认为,在以葡萄糖和硝酸钾分别作为小球藻生长的碳源和氮源时,碳氮比维持在4～5 是一种比较优化的控制条件。王素琴等[12 ]采用葡萄糖和硝酸钾对小球藻进行异养培养的结果表明,初始碳氮比为25∶1时最好。导致最佳碳氮比差异的原因既可能与实验的藻种类不同有关,也可能由于所采用的碳、氮化合物种类不同所致。一般来说, 碳占藻干质量的49 %～70 % ,而氮占藻干质量的1 %～11 % ,碳氮比应该在5 以上。因为在异养培养条件下,大约有50 %的葡萄糖会转化为二氧化碳,也就是说只有50 %左右的葡萄糖能够被藻类利用,因此在异养培养小球藻过程中碳氮比应该在10 以上。又因为小球藻可以在一定限度内进行缺氮生长,因此培养基
中的碳氮比可能更高为好。在批量培养条件下,一般获得的小球藻细胞干质量浓度都在10 g/ L 以下,而笔者筛选培养的小球藻细胞干质量浓度却可以高达26 g/ L[1 ] ,说明不同种类的小球藻的异养生长能力存在较大差异。由于批量培养不能进行碳、氮源的补料和pH的控制,存在培养初期营养物质浓度高而抑制藻类生长,而培养后期营养物质缺乏限制藻类生长的缺
点。采用发酵培养方式可以根据藻类的生长状况进行流加补料,因此可以培养出高细胞浓度的藻类。Shi 等[6 ]利用Basal 改良培养基在30 L 发酵罐中培养原核小球藻( Chlorella protothecoides CS - 41) ,最大细胞干质量浓度达到1614 g/ L 。Shi 等[10 ]用K2N 培养基培养Chlorella sorokiniana ,细胞干质量浓度可达9 g/ L 。Liang 等[14 ]应用流加工艺在5、50 、200、800、4 000 L 机械搅拌发酵罐中大规模异养培养小球藻,最高细胞干质量浓度达到43131 g/ L ,比生长速率达到01069/ h ,细胞生产率达到0162 g/ (L·h) 。Ogbon2na 等[15 ]研究了异养、自养相结合培养小球藻的方式,最终获得的细胞干质量浓度为14 g/ L 。桂林等[16 ]以大米糖化醪为碳源在发酵罐中培养蛋白核小球藻,最高细胞干质量浓度达到了1813 g/ L 。
笔者最近进行的在50 L 发酵罐中异养培养小球藻的结果显示,通过流加碳、氮源,并对pH 进行控制,可以在2 d 内获得藻细胞干质量浓度高达40 g/ L 以上的产量。上述研究结果表明,利用传统的机械搅拌发酵罐大规模异养培养小球藻效率高,具有良好的产业化应用前景。
(北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系,北京100083)
摘要:单细胞绿藻在水产养殖、环境保护、人类健康食品和重要生命活性物质生产等众多领域的研究与应用得到不断扩展,而如何高效培养出超高细胞浓度小球藻来满足各个应用领域的需要是我国亟待解决的藻类生物技术关键课题。主要针对小球藻的异养培养和重要生命活性物质的生产等方面的国内外最新研究进展进行了综述,并对重要的研究领域进行了展望。
关键词:小球藻;异养培养;生命活性物质
作为最简单的光合作用有机体,微藻有时又被称为单细胞藻类。微藻中的小球藻是一种具有重要经济价值的生物资源,有着巨大的应用和开发潜力。小球藻富含蛋白质、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、叶黄素、虾青素和多种维生素,具有极高的营养价值和提高免疫力的功能。另外小球藻还含有一种非常重要的成分———小球藻生长因子,它既具有诱发干扰
素、激发人体防御和免疫组织中的巨噬细胞、T 细胞和B 细胞的功能,又具有促进人体对环境污染有害物质解毒和排泄的作用[1 ] 。微藻属于低等植物,主要吸收二氧化碳通过光合作用合成有机物,但采用此种方法培养出的藻细胞浓度一般较低。进入20世纪70 年代以来,国外学者发现,有些小球藻可以在无光照条件下生长于有机物中[2 - 3 ] ,这不仅大幅度提高了小球藻的生长速度,而且获得了很大的藻生物量,从而引起了单细胞藻类培养的一次重要革
命。当前,美国、日本、以色列等国家和我国台湾地区等已成为小球藻的主要生产地,而我国大陆尚未发现有超高细胞浓度小球藻异养培养产业化生产的报道。
1 小球藻的培养
111 自养培养
1890 年荷兰微生物学家Beijerinck 等首先在琼脂平板上成功分离得到了小球藻的纯培养物。Otto Warburg 于1919 年将这一纯培养物在实验室进行纯培养,作为研究植物生理学的材料,研究发现,小球藻可以进行光合作用,从而为小球藻的自养培养研究拉开了序幕。小球藻的自养培养既可利用自然光,也可利用人工光照,培养基主要由无机化合物组成,最适pH 为615～715 ,最适光照强度为36～90μmol/ (m2·s) ,温度为20～30 ℃。于贞等[4 ]的研究结
果表明,pH 是影响小球藻生长的重要因素,光照强度和通气量通过影响小球藻光合作用强度而调节小球藻的生长。小球藻可以利用铵盐、硝酸盐和尿素作为氮源,添加适量的含有痕量有机酸和微量元素的土壤浸出液有利于小球藻的生长。
112 异养培养
异养培养与自养培养最大的区别是前者利用有机物作为碳源和能源,对小球藻异养培养的研究较自养培养起步晚。1953 年,Lewin 等[5 ] 首先发现了一些藻类能利用有机物作为唯一碳源和能源进行异养生长,目前对微藻异养生长机理的研究还处于初级阶段。Gladue 等针对有些微藻不能进行异养生长这一现象推测有3 种假说: ①缺乏利用有机物的酶类,如一些微藻缺乏利用某些有机物的酶。②通透性障碍。有机物必须通过细胞膜进入细胞内部才能被藻类利用,然而有些藻类缺乏吸收有机物的机制,为了克服这一问题,必须选取合适的有机物。③限制性的呼吸能力。藻类通过呼吸作用分解自身储存的物质,获得能量,维持细胞的存活。然而,有些藻类在异养条件下呼吸所产生的能量不足以维持生长及运输外界环境中的有机物。Endo 等检测了小球藻利用包括糖、有机酸和醇类等60 多种有机碳源的能力,结果表明,只有葡萄糖、半乳糖、乙酸、乙醇、乙醛、丙酮酸可分别作为唯一碳源支持小球藻的生长,其中葡萄糖、半乳糖和醋酸盐可在无光照条件下支持蛋白核小球藻的快速生长。目前,小球藻异养培养中应用最广泛的培养基是Basal 改良培养基[6 ]和K2N 培养基[7 ] 。
近年来,对于小球藻的异养培养研究受到了众多学者的重视,特别是高细胞浓度培养技术得到了较深入和广泛的探索,取得了一系列重要的研究进展[1 ,8 - 9 ] 。异养培养小球藻可以克服光自养培养的诸多缺陷,是提高小球藻产量与产率的有效途径。笔者所在课题组于2004 年从天然水体中成功筛选出了能够异养生长的小球藻种[1 ] ,发现当小球藻接种量较低时,无论是自养培养还是异养培养,生长都非常缓慢,延迟期达到3 d 以上。当增大初始藻生物量时,在黑暗条件下,小球藻生长迅速进入对数期,培养第2 d 就达到了最大生物量。在高的初始藻生物量培养条件下,无光照异养培养小球藻的生长速度远高于光照培养,因此黑暗异养培养超高细
胞浓度小球藻显示出了非常大的优势和潜力。Shi 等[10 ]研究了不同葡萄糖浓度对小球藻生长的影响,研究结果表明,当初始葡萄糖质量浓度在10～80 g/ L 时,所得小球藻细胞浓度随葡萄糖含量的升高而增大,最大细胞干质量浓度可达3112 g/ L 。但当初始葡萄糖质量浓度达到100 g/ L 时,小球藻的延迟期相对较长,生长受到抑制。Sasaki 等[11 ]在小球藻与细菌混合培养的污水处理体系中研究了葡萄糖浓度对小球藻生长规律的影响,发现当葡萄糖浓度较低时,藻细胞浓度也低,相对高的葡萄糖起始质量浓度(如50 g/ L) 可用于培养高细胞浓度的小球
藻。王素琴等[12 ]的研究结果表明,当初始葡萄糖质量浓度大于1713 g/ L 时,会抑制小球藻的生长,因此推测在用发酵罐发酵培养小球藻的过程中,应该依据小球藻的生长状况和葡萄糖的利用情况进行葡萄糖的流加控制,这样可避免高葡萄糖浓度对小球藻生长的抑制。刘世名等报道,流加分批培养小球藻时,补料液中最适碳氮比为4112。张丽君等[13 ]认为,在以葡萄糖和硝酸钾分别作为小球藻生长的碳源和氮源时,碳氮比维持在4～5 是一种比较优化的控制条件。王素琴等[12 ]采用葡萄糖和硝酸钾对小球藻进行异养培养的结果表明,初始碳氮比为25∶1时最好。导致最佳碳氮比差异的原因既可能与实验的藻种类不同有关,也可能由于所采用的碳、氮化合物种类不同所致。一般来说, 碳占藻干质量的49 %～70 % ,而氮占藻干质量的1 %～11 % ,碳氮比应该在5 以上。因为在异养培养条件下,大约有50 %的葡萄糖会转化为二氧化碳,也就是说只有50 %左右的葡萄糖能够被藻类利用,因此在异养培养小球藻过程中碳氮比应该在10 以上。又因为小球藻可以在一定限度内进行缺氮生长,因此培养基
中的碳氮比可能更高为好。在批量培养条件下,一般获得的小球藻细胞干质量浓度都在10 g/ L 以下,而笔者筛选培养的小球藻细胞干质量浓度却可以高达26 g/ L[1 ] ,说明不同种类的小球藻的异养生长能力存在较大差异。由于批量培养不能进行碳、氮源的补料和pH的控制,存在培养初期营养物质浓度高而抑制藻类生长,而培养后期营养物质缺乏限制藻类生长的缺
点。采用发酵培养方式可以根据藻类的生长状况进行流加补料,因此可以培养出高细胞浓度的藻类。Shi 等[6 ]利用Basal 改良培养基在30 L 发酵罐中培养原核小球藻( Chlorella protothecoides CS - 41) ,最大细胞干质量浓度达到1614 g/ L 。Shi 等[10 ]用K2N 培养基培养Chlorella sorokiniana ,细胞干质量浓度可达9 g/ L 。Liang 等[14 ]应用流加工艺在5、50 、200、800、4 000 L 机械搅拌发酵罐中大规模异养培养小球藻,最高细胞干质量浓度达到43131 g/ L ,比生长速率达到01069/ h ,细胞生产率达到0162 g/ (L·h) 。Ogbon2na 等[15 ]研究了异养、自养相结合培养小球藻的方式,最终获得的细胞干质量浓度为14 g/ L 。桂林等[16 ]以大米糖化醪为碳源在发酵罐中培养蛋白核小球藻,最高细胞干质量浓度达到了1813 g/ L 。
笔者最近进行的在50 L 发酵罐中异养培养小球藻的结果显示,通过流加碳、氮源,并对pH 进行控制,可以在2 d 内获得藻细胞干质量浓度高达40 g/ L 以上的产量。上述研究结果表明,利用传统的机械搅拌发酵罐大规模异养培养小球藻效率高,具有良好的产业化应用前景。
