【原创】制造转GFP荧光蛋白基因的大肠杆菌

12年7个月前 IP:未同步

操作

首先要制备大肠杆菌的感受态细胞，以便于接收外源基因。
所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。通常用0.1M CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源 DNA进入细胞。本实验中使用了热击法转化。

材料
    LB液体培养基培养XXXXli TG1至OD600约为0.4.
    0.1M CaCl2（含10%甘油）
    氨苄青霉素(100mg/mL)
    阿拉伯糖
    LB固体培养基
仪器
    冷冻离心机
    无菌操作台
    微量移液器
    水浴锅

方法
感受态的制备与转化
①取菌液1.5mL，8000rpm×1min离心，弃上清（尽量除尽，下同）。
②加入600μL预冷的0.1M CaCl2溶液，悬浮沉淀，4℃离心4000rpm×1min，弃上清。
③加入400μL预冷的0.1M CaCl2溶液，4℃离心4000rpm×1min，弃上清。
④加入200μL预冷的0.1M CaCl2溶液，冰浴20min，4℃离心4000rpm×1min，弃上清。
⑤加入100μL预冷的0.1M CaCl2溶液，4℃冰箱放置。
至此制成感受态。

摇床上培养到OD600=0.48的XXXXli TG1

超净台准备

离心

涡旋震荡。只有第一次加氯化钙时可以，后期不行，因为感受态细胞结构不完整，极易因为震荡操作裂解。

丢入冰箱备用

接下来就是外源基因的转化。
我使用的含有GFP基因的质粒，是实验前人构建的。图谱没有找到，十分遗憾，知道的只有含有氨苄抗性，阿拉伯糖操纵子下连接GFP基因。
质粒溶液含DNA 4400ng/μL,本次实验使用1μg进行转化，故取用0.227μL质粒溶液。
取制备好的感受态细胞，分别向其中加入质粒，冰浴10min，42℃热激90s，冰浴3min，加入800μL LB液体培养基，37℃复苏20min，取100μL涂布于GFP平板上，37℃倒置培养20h。
设置对照
转化        空LB    Amp    Ala    Amp+Ala
未转化     空LB    Amp    Ala    Amp+Ala

结果

转化                  空LB            Amp         Ala                Amp+Ala
菌落数            无法计数         11         无法计数              12

未转化               空LB            Amp        Ala                 Amp+Ala
菌落数            无法计数          0         无法计数               0

转化组
Amp