对于一个经常搞PCR检测的人我告诉你很简单。PCR仪器没发明前其实就是三口水浴锅三个温度扩增DNA片段。但是要是要扩增RNA的话还需要再多一口水浴锅进行反转录。一般市售的PCR试剂(仅仅讨论DNA扩增不讨论RNA扩增)就是95℃预变性大约2分钟(看不同厂家给你推荐的条件执行),****接下来就是循环过程95℃30S变性,55℃(这个温度根据引物来定一般不确定,总的来说范围就是50到65之间),然后72℃延伸30s(时间是不固定看你扩增的上下游引物之间究竟有多少个碱基对,一般PCR酶延伸速度大约1400个碱基对每分钟,也有一些慢的也有一些超速的这个问试剂厂家要资料。)接着回到***这里循环个30次。下一个阶段就是72℃5分钟左右保温这个看试剂吧。接着就降温到4度直接就方冰上就结束。
三口水浴锅 分别设置95℃, 55℃(就是***步骤中的这个55温度),72℃。把配好后的PCR体系混分装好到0.2mL离心管中然后加入提取好的DNA。然后盖好盖。用手把液体摔下管底。因为PCR反应体系很小一般就25微升。然后根据实验条件分别在几口水浴锅中转移最后就转移到冰上结束。这个实验90年代80年代那会还是一群博士一两个钟拿着表蹲在实验室水浴锅就来回把管子转来转去。再简易版用家用保护水壶这些都能干。就人累点。实际效果其实不比什么半导体制冷 加热底座啥的差。
实际上还有更加方便快速的就是微流控芯片淘宝有定制 分布压上三个不同稳定把反应体系通过毛细通到泵进去来回穿越这三个温度区就完成这个更快。
PCR试剂现在都很便宜非常非常便宜,新冠之后国内原来默默无闻的各种公司都自己能提供试剂不断扩大产能基本100块钱你就能买到200次反应的试剂。pcr反应投入大的是移液器这些微量加样设备这玩意太贵,还要耗材。我那个实验室一个星期就能消耗掉好几公斤的枪头。pcr全程都要环境有要求,颗粒物,菌含量啥的,虽然普通环境也行,但是你要是特定样本就麻烦。
PCR最重要的也是最核心的一个是引物设计。卖仪器给你你是做不了的。因为你要确定你pcr扩增的是什么目标序列。你需要先对目标序列进行引物设计。这些都是有软件帮你解决。你怎么找到特定基因序列那就是有一定专业背景的人才能知道哪里去找。找到后还要分析同样的基因究竟有多少的型等等就看你数据挖掘能力了。然后把这些序列都拿去做同源比对要找到这些基因保守区啥啥的引物设计最终是要都扩增出来一系列还是只扩增某一个型都是你的目标。然后就把引物设计落在哪一个区设计出来的引物你还要各种分析挑选。把引物自身能跟自身匹配的去掉。还有什么嘌呤啥的含量比控制好等等非常复杂的又是专业玩意,学过分子生物学的毕业论文必须自己操刀。接着都设计好就交给专业公司合成你的序列。这个现在价格很便宜合成一对引物100来块钱够你用上千次。
生物实验实际上很多可以仪器把复杂高大上东西解决,但是前期准备太多太复杂。这些不是化学实验物理实验室这些能比的。而且生物实验室其实复现效果都不好。就像在家搞业余pcr实验室。你不仅要设计引物,还要提取核酸。提取核酸虽然可以买商业化试剂盒。要么就是硅胶柱吸附的你就要冷冻高速离心机。要么磁珠法你有需要专用磁力架(不公品牌不通用),磁珠法还有专门设计出来给全自动提取仪使用同样不兼容其它品牌。冷冻离心机随便好几万,磁力架好几百。一个50头份提取试剂盒基本好几百。移液器至少三把不同量程也好几千。反倒是pcr试剂最便宜 引物最便宜,pcr仪器还没有离心机贵。还有你准备移液器枪头这些虽然可以买到以前商业化灭菌枪头不需要自己灭菌你一买就人家让你至少一项起步。都是2000支甚至那些10微升枪头就要2w支起步。
还有把PCR扩增好的产物你总要看结果。又加多一套凝胶成像相关的玩意,又一堆缓冲液。电泳仪 便宜的几千国产就行,电泳槽国产便宜也要1千多,微波炉,琼脂糖(不是琼脂),还有凝胶成相设备(虽然302或者365nm紫外波长投射电泳后的凝胶外加一个过滤紫外滤镜手机都能拍照片。)还有核酸凝胶电泳用到的核酸染色剂非常贵0.5ml 600块。关键这玩意便宜的有毒你买不到,那些宣称没毒不会渗透进皮肤的又贵。虽然一次一块凝胶才用到0.5微升不到染色剂。反正这一套玩意下来没个5w不行。
从提取dna到扩增dna到看核酸扩增结果实际上PCR仪就是最便宜也就是表明上是周天子,实际上提取核酸到看结果这一套玩意都要围绕它转。这些才是诸侯。没有这些pcr仪器就是一个升温降温的玩意(不然那玩意怎么叫做热循环仪)。
生物学试验那是前期投入非常多周边设备和外围设备。一个实验涉及到前处理到检测到出结果层层衔接都是单向的又相互影响下一步。更加不用说试验重复性控制这个难题。
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